موضوع مقاله : آزمایشگاه ها

عنوان مقاله : روش های آماده سازی و تصویربرداری از نمونه های زیستی با استفاده از میکروسکوپ الکترونی عبوری کرایـو

روش های آماده سازی و تصویربرداری از نمونه های زیستی با استفاده از میکروسکوپ الکترونی عبوری کرایـو

تاریخ : 1396/10/23تعداد بازدید : 996

میکروسکوپ الکترونی عبوری کرایو نوعی از میکروسکوپ الکترونی عبوری مرسوم بوده که نمونه زیستی درون آن در دمای تبرید (معمولا برابر با دمای نیتروژن مایع) بررسی میشود. لازم به ذکر است تا پیش از به وجود آمدن روش میکروسکوپ الکترونی کرایو، دو روش برتر و محبوب برای بررسی ساختار نمونه های زیستی در سطح مولکولی و اتمی با عناوین: بلور نگاری با استفاده از اشعه ایکس و طیف سنجی تشدید مغناطیسی هسته ای در اختیار محققان بوده اند. به دلیل محدودیت ساختار این مقاله از شرح دو روش فوق خودداری میشود. چالش های موجود در هر یک از این دو روش و نیاز محققان برای به حداقل رساندن میزان تخریب نمونه های زیستی توسط اشعه الکترونی برای تشخیص بهتر، منجر به ابداع روش TEM-CRYO شد. مقدار الکترون های ساطع شده از تفنگ الکترونی میکروسکوپ TEM که برای تصویربرداری از نمونه عبور میکند به اندازه ای است که قادر به تخریب ساختارهای حساس آن است. علاوه بر این، خلا بالای موجود در ستون میکروسکوپ الکترونی، محیط کاملا نامناسبی را برای
نمونه ی زیستی ایجاد می کند.

محققان برای غلبه بر چالش خلا از روش رنگ آمیزی منفی استفاده کردند که تا حدودی موفقیت آمیز بود. به دلیل اعمال مرحله آبگیری و جایگزین نمودن آب درون نمونه با رزین پلاستیکی، نمونه های زیستی درصورت قرار گرفتن در معرض تابش مستقیم الکترونها مستعد به تخریب هستند. آب دشمن شماره یک متخصصین حوزه آماده سازی نمونه های زیستی برای میکروسکوپ الکترونی محسوب میشود. در بیشتر مواقع حتی با تجربه ترین متخصصان آماده سازی نمونه های زیستی در مرحله آبگیری مقلوب این دشمن میشوند (بدین معنی که مولکولها پس از خارج کردن آب از نمونه تخریب میشوند). محققان پس از تلاشهای بی شمار به این نتیجه رسیدند که با خنک نگاه داشتن نمونه زیستی میتوان بر این چالش غلبه نموده و این دشمن را به یک دوست مفید مبدل ساخت. به طور کلی هدف اصلی از بکارگیری روش کرایو، انجماد سریع نمونه های زیستی بدون از بین بردن یا جایگزینی مایع درون آنها است.

استفاده از میکروسکوپ الکترونی عبوری کرایو به محققان کمک میکند که بدون استفاده از رنگ های در برگیرنده فلزات سنگین (نظیر: اورانیل استات، سیترات سرب و غیره) کمپلکس های زیستی از قبیل: ویروس ها، ریبوزومها، میتوکندری ها، کانال های یونی و درشت مولکولهای 200 کیلو دالتونی یا بزرگتر ثابت نگاه داشته شده درون محیط یخ شیشه ای را مشاهده و تفسیر کنند. درصورت آماده سازی نمونه با کمک روش کرایو از مواردی نظیر: وقوع تغییرات فراساختاری، توزیع مجدد المان ها و شسته شدن مواد تشکیل دهنده ی نمونه جلوگیری به عمل می آید. به منظور حصول تصاویری باکیفیت و رزولوشن بالا از نمونه هایی که بهطور سریع منجمد شده باید شرایط ذیل فراهم باشد: الف- کنترل و ثابت نگاه داشتن دمای انجماد نمونه در تمامی مراحل آماده سازی و تصویربرداری و ب- به حداقل رساندن ضخامت نمونه ی(  300-100 nm)  قرار گرفته شده روی گرید. بیشتر میکروسکوپ های الکترونی عبوری کرایو برای ارائه رزولوشن بالا، در برگیرنده ولتاژ 300 کیلوولتی هستند. بنابراین، میانگین الکترون های ساطع شده با کمک منبع 300 کیلوولتی پیش از پراکنده شدن، تنها از 260 نانومتر از سلول عبور می کنند. به همین دلیل در پایان مراحل آماده سازی باید نمونه ای با ضخامت کمتر از 500 نانومتر به دست آید. به طور معمول به منظور کمینه سازی تخریب نمونه های قرار گرفته تحت اشعه در هنگام تصویربرداری از حالت دوز پایین الکترون استفاده می شود (حدود دوز الکترون در این حالت برابر با e/A2 10-20 است). علیرغم مزایای قابل توجه روش میکروسکوپ الکترونی کرایو برای مشاهده ی درون سلولها با رزولوشنی نزدیک به سطح اتمی، این روش دارای معایبی نیز بوده که در ادامه این مقاله به آنها پرداخته می شود. 

میکروسکپ الکترونی عبوری TEM